PRÁCTICA #2 Prueba de susceptibilidad a antibióticos

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE NAYARIT

UNIDAD ACADÉMICA DE CIENCIAS QUÍMICO BIOLÓGICAS Y FARMACÉUTICAS

PROGRAMA DE QUÍMICO FARMACOBIÓLOGO

BACTERIOLOGÍA MÉDICA

PRACTICA No. 2

Prueba de susceptibilidad a antibióticos

Q.F.B. DORA LILIANA LUNA VÁZQUEZ

Q.F.B. CARLOS ISIDRO RODRÍGUEZ MORALES

Q.F.B. NADIA ROXANA MARTÍNEZ RUBIO

 

INTRODUCCIÓN

Las relaciones mutuas que existen entre los microorganismos son semejantes a las de los demás organismos vivientes, y van desde la asociación sinérgica y benéfica, hasta las antagónicas.

En la naturaleza numerosos microorganismos viven una vida asociada donde unen sus capacidades para lograr transformaciones imposibles de realizar separadamente. Cuando de una vida separada se logran beneficios mutuos, hay simbiosis, o cuando de ella puede resultar solamente una especie beneficiada sin sufrir daño la otra hay comensalismo.

Las relaciones antagónicas aparecen frecuentemente entre los microorganismos saprófitos  y parásitos patógenos. En general,  la mayor parte de los microorganismos patógenos son parásitos estrechamente adaptados, mal dotados para sobrevivir a los rigores de una intensa competencia con una flora microbiana mixta fuere del organismo huésped. Las defensas corporales normales y de inmunidad bastan, por lo regular, para proteger al individuo. No obstante, en algunas ocasiones se necesitan medios adicionales para la protección del hospedero. La quimioterapia es el tratamiento de las enfermedades por sustancias químicas que inhiben o destruyen al agente agresor, y que además, no lesionan al huésped en las concentraciones empleadas.

Los antibióticos son producidos por los organismos más variados, principalmente bacterias y hongos inferiores, y algunos se obtienen por síntesis en el laboratorio. Su clasificación se basa principalmente en la estructura química y en el mecanismo de acción de cada uno de ellos.

Ya que el tratamiento antimicrobiano es uno de los pilares fundamentales para combatir las enfermedades infecciosas, existen varios métodos útiles en la selección de un régimen antibiótico, siendo la prueba más comúnmente usada la de Kirby – Bauer o técnica de difusión en disco. Ésta es fácil de realizar y de bajo costo y nos brinda información cualitativa o semicuantitativa.

La prueba de mayor confiabilidad cuantitativa implica diluciones seriadas de antibiótico en agar sólido o en medios de caldo, que contiene un cultivo de microorganismo de prueba, éste método da dos resultados cuantitativos: la concentración mínima inhibitoria, y la concentración mínima bactericida. El valor de un agente químico se evalúa determinando la concentración mínima para matar o inhibir el crecimiento microbiano (MIC). Para el médico el valor de la MIC permite dosificar el antibiótico para inhibir el desarrollo bacteriano en el sito de la infección.

PROPÓSITO ESPECÍFICO DE LA PRÁCTICA

Determinar la concentración mínima inhibitoria de un antibiótico hacia un microorganismo, mediante la técnica de dilución en caldo, además de emplear la técnica de Kirby Bauer para orientar al médico en la elección adecuada del tratamiento a seguir.

CRITERIOS DE DESEMPEÑO

La persona estará capacitada para determinar la MIC, cuando:

Sepa utilizar las técnicas de siembra y utilizar los medios de cultivo adecuados para el aislamiento de una cepa bacteriana.
Sepa caracterizar una cepa bacteriana aislada.
Utilice los diferentes métodos para la elección del antibiótico adecuado.
Maneje los fundamentos de las diferentes técnicas empleadas en esta práctica.

DESARROLLO DE LA PRÁCTICA

Material y equipo

Tubos de ensaye con tapón de rosca

Cajas de petri

Pipetas serológicas de 1 mL y de 5 mL estériles

Mechero

Gradilla

Hisopos estériles

Sensidiscos para gram  positivos y negativos

Regla

Autoclave

Estufa bacteriológica ajustada a 37°C

Espectrofotómetro

 

Medios y reactivos         

Agar Mueller – Hinton

Caldo soya  tripticasa

Solución salina fisiológica

Cepa bacteriana caracterizada

Tubo 0.5 del Nefelómetro de McFarland (10⁸ bacterias/mL).

METODOLOGÍA

Método de Kirby – Bauer

Factores a considerar:

·         El espesor del medio de cultivo debe de ser aproximadamente 4 mm.

·         El inóculo debe tener una concentración de bacterias de 10⁸ bacterias/mL.

·         Se requiere que el cultivo este en la fase log de crecimiento, este se logra  a las 4 – 6 horas de incubación.

·         Una vez ajustada la turbidez del caldo, no deben pasar más de 20 minutos antes de sembrarse en el medio.

1.       Ajustar la concentración de la cepa bacteriana a 10⁸ bacterias por mililitro en fase logarítmica. Esto se logra tomando unas 4 o 5 colonias aisladas del mismo tipo morfológico e inoculándolas en 4 mL de caldo soya tripticasa. Se incuba el caldo hasta que adquiera una ligera turbidez (aproximadamente en 4 horas). Después la turbidez se ajusta con solución salina estéril hasta que sea equivalente al estándar 0.5 de MacFarland).

2.       Con un hisopo estéril tomar muestra del cultivo bacteriano previamente ajustado. Para ello, se introduce el hisopo en el tubo, se elimina el exceso de líquido oprimiendo el hisopo en las paredes del tubo, e inocular de forma masiva el medio.

3.       Dejar que seque el inóculo.

4.       Tomar el sensidisco con la ayuda de unas pinzas, previamente esterilizada el fuego.

5.       Colocar el sensidisco sobre la superficie del agar, presionándolos ligeramente.

6.       Incubar de 18 – 24 horas.

7.       Medir los halos de inhibición.

8.       Las cepas se clasifican como sensibles o resistentes de acuerdo a los datos dados por la casa comercial. Por ejemplo:

RESUMEN DEL PROCEDIMIENTO DE LA PRÁCTICA:

Primera sesión de laboratorio:
1. Tomar con el asa en pico 4 o 5 colonias del cultivo proporcionado por el docente, e inocularlas en el caldo soya tripticasa.
2. Incubar.

Segunda sesión de laboratorio:
1. Ajustar la turbidez del cultivo al tubo estándar 0.5 de MacFarland, con solución salina estéril.
2. Inocular de forma masiva el medio y colocar los sensidiscos.
3. Incubar.

Tercera sesión de laboratorio:
1. Medir los halos de inhibición. 


 

CUESTIONARIO

1.       ¿Por qué se usa el agar Mueller – Hinton para la realización de las pruebas de susceptibilidad por el método de Kirby - Bauer? 

2.       ¿Cuál es el objetivo de obtener una concentración de 10⁸ por mL de las bacterias que se van a inocular? 

3.       ¿Cuáles son las limitaciones de la prueba? 

4.       ¿Qué otras pruebas de susceptibilidad bacteriana a antibióticos existen?