lunes, 14 de febrero de 2011

PRÁCTICA #1 Medios de cultivo y pruebas bioquímicas



UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE NAYARIT

UNIDAD ACADÉMICA DE CIENCIAS QUÍMICO BIOLÓGICAS Y FARMACÉUTICAS

PROGRAMA DE QUÍMICO FARMACOBIÓLOGO

BACTERIOLOGÍA MÉDICA

PRÁCTICA No.1

MEDIOS DE CULTIVO Y PRUEBAS BIOQUÍMICAS

Q.F.B DORA LILIANA LUNA VÁZQUEZ
Q.F.B. NADIA ROXANA MARTÍNEZ
Q.F.B. CARLOS ISIDRO RODRÍGUEZ MORALES


NUMERO DE ALUMNOS POR UNIDAD DE PRÁCTICA: 24 Alumnos

INTRODUCCIÓN

El aislamiento de los microorganismos en los diferentes medios de cultivo empleados en Bacteriología Médica, es uno de los fundamentos más importantes para llevar a cabo una bueno caracterización del microorganismo. En Bacteriología se emplean diferentes tipos de medios de cultivo y pueden clasificarse de acuerdo a su estado físico, a su composición y al uso que se destinan.
Según su estado físico, los medios se dividen en:
  1. Medios líquidos
  2. Medios semisólidos
  3. Medios sólidos

Según su composición los medios pueden ser:
  1. Medios simples
  2. Medios enriquecidos

De acuerdo al uso a que se destinan, los medios de cultivo pueden ser:
  1. Medios de propagación y enriquecimiento
  2. Medios diferenciales
  3. Medios de conservación

El uso de la técnica apropiada en la inoculación de medios de cultivo dará por resultado un rápido crecimiento de cultivos viables que son de gran importancia en la identificación bacteriana.
Las siembras se practican por lo general valiéndose de asa, alambres o hisopos estériles.
Las siembras deben hacerse evitando movimientos bruscos o excesiva lentitud en las manipulaciones para evitar contaminaciones. Además de realizarse en un área estéril, generalmente formada por mecheros.

Cuando una bacteria se tiene ya cultivada y aislada, es de suma importancia conocer el género y la especie de dicha bacteria, para lo cual se utiliza el término caracterización.
La caracterización de una cepa bacteriana aislada en un medio de cultivo se realiza con base a sus propiedades metabólicas, tomándose en cuenta principalmente la utilización de ácidos orgánicos,  aminoácidos, sales, pH,  enzimas, entre otras, como fuente de nutrición.

Para dicho procedimiento se utilizan medios de cultivo específicos que nos ayudarán a determinar la actividad metabólica de algún microorganismo y, de esa manera, realizar la caracterización correspondiente.

El juego de pruebas bioquímicas a utilizar dependerá de la orientación que nos den los medios de cultivo que se emplearon para el aislamiento de la bacteria.
Entre las características bioquímicas mas utilizadas para la caracterización de una cepa bacteriana pura se tiene:
  • Movilidad
  • Formación de indol
  • Fermentación de carbohidratos
  • Prueba del rojo de metilo
  • Utilización del citrato
  • Producción del ácido sulfhídrico
  • Hidrólisis de la urea
  • Reducción de nitratos
  • Descarboxilación y/o desaminación de aminoácidos
  • Producción de fenilalanina desaminasa
  • Prueba de la coagulasa
  • Prueba de la oxidasa
  • Prueba de la catalasa
  • Producción de hemólisis

PROPÓSITO ESPECÍFICO

El alumno recordará la técnica de Gram, como método de clasificación de bacterias, así como el empleo de los diferentes tipos de medios de cultivo y   las técnicas de siembra empleadas para cada uno de ellos con la finalidad de obtener colonias aisladas o cultivos masivos.

El estudiante será capaz de seleccionar y utilizar las pruebas bioquímicas indicadas para la caracterización de una cepa bacteriana.


CRITERIOS DE DESEMPEÑO

El alumno estará capacitado para utilizar los diferentes medios de cultivo, emplear técnicas de inoculación y clasificar las bacterias por medio de la tinción de Gram cuando:

  • Sepa utilizar las pruebas bioquímicas que ponen de manifiesto las actividades metabólicas que llevan a cabo los microorganismos
  • Aplicar estas actividades en la diferenciación de bacterias.
  • Aprender el fundamento de cada una de las diferentes pruebas bioquímicas empleadas, para que el alumno identifique la bacteria presente en una muestra.








NORMAS DE SEGURIDAD ESPECÍFICA DE LA PRÁCTICA

Cuadro de detección de riesgos

RIESGO
SOLUCIÓN
Quemaduras
Debido a la utilización de mecheros es posible, si no se trabajo en forma adecuada, que ocurran quemaduras accidentales, en dado caso, informar al profesor y éste le indicará lo que se debe de hacer.
Rompimiento de material que contenga crecimiento bacteriano.
Lo primero que se debe de hacer en estos casos es:
  1. No tocar los vidrios rotos.
  2. Vertir sobre el material cloro o benzal.
  3. Dejar por un momento
  4. Recoger el material y tirarlo en bolsa roja.


Cuadro de disposición de desechos.

Tipo de desecho
Disposición
Medios de cultivo con crecimiento
Los medios que hayan sido empleados serán esterilizados primeramente 20 minutos a 15 lb, para posteriormente ser lavados.
Portaobjetos con muestras teñidas
Como este material se fija al calor no hay problema de contaminación por lo que podrán ser lavados y reutilizados o tirarlos en el desecho para material de punzocortantes.


NORMAS OFICIALES MEXICANA ESPECÍFICAS DE LA PRÁCTICA

  • NOM – 002 – STPS – 2000. Condiciones de seguridad, prevención, protección y combate de incendios en los centros de trabajo.

  • NOM – 017 – STPS – 2001. Equipo de protección personal. Selección, uso y manejo en los centros de trabajo.

  • NOM – 052 – ECOL – 1993. Establece las características de los residuos peligrosos, el listado de los mismos y los límites que hacen a un residuo peligroso por su toxicidad al ambiente.
  • NOM – 087 – ECOL – SSA1 – 2002. Protección ambiental. Salud ambiental. Residuos peligrosos biológicos infecciosos. Clasificación y especificaciones de manejo.

DESARROLLO DE LA PRÁCTICA

  1. Material


  • 1 gradilla
  • 3 tubos de ensaye 13X100 con tapón de rosca
  • 2 cajas de petri
  • 1 Asa calibrada
  • 1 Asa en pico
  • 4 portaobjetos
  • Microscopio
  • Mechero de bunsen
  • Papel de estraza
  • Algodón
  • Estufa de incubación a 37°C

  1. Reactivos


  • Caldo soya y tripticaseína o caldo nutritivo
  • Agar soya y tripticaseína o agar nutritivo
  • Cristal violeta
  • Lugol
  • Alcohol – cetona
  • Benzal
  • Agua
  • Safranina
  • Aceite de inmersión
  • Benzal
  • Cepa proporcionada por el profesor titular.

Metodología


  1. La preparación de reactivos y medios de cultivo se consideran en el Anexo 1.
  2. Limpiar el área de trabajo
  3. Encender los mecheros y cerrar las ventanas y puertas para evitar las corrientes de aire.
  4. Rotular los tubos y cajas de petri empleados con los siguientes datos: Número de equipo, grupo y fecha.
  5. Sembrar en cajas de petri de la siguiente manera:

Caja No. 1
Para aislamiento de colonias
  1. Tomar el asa calibrada y quemarla al mechero
  2. Enfriar y tomar una pequeña asada del tubo que contenga la muestra problema.
  3. Tomar la caja de petri y colocar el asa con la muestra en un determinado punto cercano a la orilla de la caja.
  4. Realizar una estriación de lado a lado.
  5. Quemar nuevamente el asa y retomar la muestra en el punto final de la primera estriación de tal manera que se vuelve a estriar.
  6. Repetir el paso anterior.
  7. Por último realizar una estriación separada quedando el final en el centro.


    CAJA No.2
    SEMBRADO EXPANSIVO
  8. Esterilizar el asa al fuego
  9. Tomar muestra con el asa estéril de la cepa proporcionada.
  10. Se realiza un estriado parejo y masivo por toda la caja.
  11. Esterilizar nuevamente el asa.







    TUBO NO.1
    SIEMBRA EN CALDO
  12. Con un asa calibrada, esterilizada previamente se toma una asada de la muestra.
  13. Destapar el tubo con el caldo e introducir el asa sin tocar el fondo y realizar movimientos circulares.
  14. Sacar el asa y tapar el tubo.
  15. Esterilizar el asa.

TUBO No.2
SIEMBRA EN TUBO CON AGAR PARADO
  • Tomar el asa en pico y esterilizar al fuego.
  • Enfriar el asa y tomar una asada de la cepa proporcionada.
  • Introducir el asa al medio evitando llegar al fondo, preferiblemente 0.5 cm antes del fondo y sacarla.
  • Tapar el tubo y esterilizar el asa.

TUBO No.2

SIEMBRA EN TUBO INCLINADO
  • Se emplea un asa en pico para la toma y siembra de la muestra.
  • Esterilizar el asa y tomar un poco de muestra.
  • Introducir el asa hasta el fondo del medios sin tocar el fondo, en la parte inclinada realizar una estriación.
  • Cerrar el tubo y esterilizar el asa.

  1. Recuerda siempre mantener el material cerca del mechero para evitar contaminación.
  2. Todos los medios sembrados se dejan incubar a 37°C por 24 a 48 horas para observar el crecimiento.
  3. Las cajas se incuban boca abajo.
  4. Los tubos no se cierran herméticamente.
  5. Transcurrido el tiempo, observar el crecimiento y realizar la tinción de Gram de la siguiente forma:
  • Tomar un portaobjeto y marcarlo adecuadamente.
  • Agregar una gota de agua destilada.
  • Tomar una asada de la caja o tubo donde hubo crecimiento y expandir la muestra sobre el agua.
  • Se deja secar (fijación de bacterias).
  • Una vez fijada la muestra se coloca sobre dos varillas de vidrio en la tarja.
  • Se colocan unas gotas de cristal violeta sobre la muestra.
  • Dejar reposar 1 minuto.
  • Se lava con agua corriente sin poner al chorro directo.
  • Se le agrega lugol a la muestra, y se deja reposar por un minuto.
  • Lavar con agua corriente.
  • Se coloca alcohol – cetona por 30 segundos y lavar.
  • Se adiciona safranina y se deja actuar por un minuto.
  • Se lava con agua corriente y se deja secar el portaobjetos.
  • Observar al microscopio con objetivo 10X para enfocar y después con el objetivo 100X adicionando al portaobjetos una gota de aceite de inmersión.
  • Observar las formas de las bacterias y su coloración para reportar los resultados.

METODOLOGÍA PARA PRUEBAS BIOQUÍMICAS

  1. De una de las colonias características (es decir que su morfología coincida con algún género bacteriano y que en el gram se observe una sola morfología) aislada e identificada su morfología microscópica, resembrar en las pruebas bioquímicas empleando la técnica más adecuada.
  2. Incubar a 37°C por 24 a 48 horas. El tiempo de incubación para cada bioquímica se específica en la tabla de resultados esperados.
  3. Transcurrido el tiempo de incubación observar cada una de las bioquímicas y comparar con el siguiente cuadro.



Prueba bioquímica
Interpretación de resultados
Kligler
Glucosa positivo
Amarillo el fondo
Lactosa positivo
Amarillo el pico

Gas positivo
Formación de burbujas principalmente en el fondo
H2S positivo
Formación de precipitado negro.
Se reporta como K = alcalino y/o A = ácido
RM – VP
En este medio el caldo con crecimiento se divide en dos tubos diferentes una para el rojo de metilo y el otro se empleará para el Voges Proskauer
Al primer tubo se adicionan 5 gotas de rojo de metilo. Si el medio vira a rojo se reporta como RM positivo, sino se reporta como negativo.
En el tubo restante se adicionan 2 gotas de KOH y 5 gotas de alfa – naftol. Si el medio vira a un color rosa fuerte se reporta como VP positivo, sino se reporta como negativo.
Citrato de Simmons
Después de la incubación si el medio viró de su color original (Verde) a azul se reporta como positivo. Si el medio permanece igual se reporta como negativo.
MIO
H2S positivo
Formación de precipitado negro
Movilidad positiva
Turbidez en regiones alejadas de la picadura.
Ornitina positiva
Vire del medio a un color morado intenso.
Indol positivo
Añadir al medio 3 – 5 gotas de reactivo de Kovac´s. Si se forma un anillo rojo sobre el medio se considera positivo.
LIA
Desaminación de la lisina
Pico rojizo/fondo amarillo
Descarboxilación de la lisina
Positiva: todo el tubo púrpura/violeta
Negativa: pico púrpura/fondo amarillo
H2S positivo
Formación de precipitado negro.
Se reporta de la siguiente manera: R = rojo; A =  amarillo; K = púrpura
Urea
Si el medio cambia a un rosado intenso se considera positivo; si el medio permanece sin cambios se considera negativo.
Fenilalanina desaminasa
Agregar 4 – 5 gotas de cloruro férrico al 10%. Si el pico cambia verde se considera positivo; si no presenta cambios el medio se considera negativo.
SIM
H2S positivo
Formación de precipitado negro
Indol positivo
Agregar 5 gotas del reactivo de Kovac´s, si se forma un anillo rojo se considera positivo.
Movilidad
Crecimiento a los lados de la línea de picadura.


CUESTIONARIO

  1. Explica el fundamento de lo medios de cultivo empleados en la práctica.
  2. Explica el fundamento de la tinción de Gram.
  3. Explica el fundamento de las pruebas bioquímicas empleadas.
  4. Haz una comparación: resultados de las pruebas bioquímicas de la cepa estudiada, lo que indica la bibliografía y lo que obtuviste en el laboratorio.
Publicado por QFB Carlos Isidro Rodríguez Morales en 15:54

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